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神经元突触细胞微灌流系统
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  • question XonaMicrofluidicsLLC美国公司神经元突触轴突培养舱MicrofluidicChamber

    突触虽然是神经系统重要的功能单位,但针对突触的通用研究方法仍具有一定局限性,有待完善改进,为加深对突触发生、病变现象及机制的研究,本实验设计建立创新性研究方法,实现体外动态观察神经元突触结构的变化。 【设计思路】 本实验引入新型培养装置MicrofluidicChamber和跨突触结构重组GFP荧光蛋白对mGRASP实现神经元突触体外动态观察。MicrofluidicChamber有双侧培养空间,由微通道相通,仅能允许神经元轴突通过,同时根据流体动力学原理其双侧液体不会发生混合。mGRASP全称为mammalianGFPreconstitutionacrosssynapticpartners,包括Pre和Post两个蛋白,分别携带GFP蛋白的一部分,当二者距离约为20nm左右时,能重组成GFP发出绿色荧光,反之则无荧光信号。Pre和Post通过neurexin和neuroligin固定表达在突触前膜和突触后膜上,利用突触间隙约为20nm且小于正常细胞间距的原理,用绿色荧光特异性标记突触,体外动态观察突触结构。 【实验内容】 本实验在新型培养装置MicrofluidicChamber进行孕17天小鼠胎鼠皮层神经元原代培养,体外培养6~7d,在两侧分别加入携带mGRASPPre和Post基因的慢病毒感染神经元,基于MicrofluidicChamber良好的液相分隔性,能做到两侧分别表达Pre和Post蛋白,而不会出现二者同一细胞中共表达的情况。培养4周左右,表达Pre的神经元轴突穿过微通道与另一侧表达Post的神经元接触,形成突触后即可在突触间隙发出绿色荧光。可在培养基中加入神经营养因子或药物,体外动态观察生理、病理刺激对突触结构的影响。 【材料】 实验动物为孕17dICR小鼠;MicrofluidicChamber购自Xonamicrofluidics公司,货号为RD450;mGRASP基因由Dr.JinhyunKim惠赠。 【可行性】 在MicrofluidicChamber中进行神经元原代培养为已掌握技术;mGRASP蛋白已在细胞中表达,能检测到绿色荧光,证明实验可行。 【创新性】 由于突触结构的特性和通用标记方法大多具有细胞毒性,目前尚无较好办法实现神经元突触的体外动态观察,mGRASP作为荧光蛋白无明显细胞毒性,表达后仍可进行长期观察。mGRASP的应用必须基于Pre和Post独立表达,一旦在同一细胞中共表达即可发出绿色荧光,失去特异性标记突触的作用,因此mGRASP多通过定位注射的方式应用于在体实验,本实验设计创新性的利用MicrofluidicChamber良好的液相分隔性,实现了mGRASP的体外应用,进而动态观察突触结构。

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      Xona Microfluidics llc公司提供的神经元设备是由光学透明和生物惰性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造的。XONA神经元培养系统--这个神经元装置由两个由微槽连接的腔室组成。这个装置由两个连接着一个很小的微槽隔板的腔室组成。设备一侧的腔室体积大于更一侧,体积的差异形成流体静力学,因此两个腔室形成静水压力,造成液体流动。

      XONA神经元培养系统--该设备的总体积约为600微升,这使得研究人员可以少使用在神经元培养中使用的昂贵试剂。该神经元装置也使其有可能进行轴切术(通过在远端腔内的真空吸气来切割轴突)并观察其再生。
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