突粘弹性能和耐损伤中。轴突细胞骨架的组合物对确定轴突弹性和轴 突易感性损坏的程度至关重要，因为轴突细胞骨架的各组分具有不同的弹性特性。神经丝 比肌动蛋白更有弹性，比微管更柔软，并能承受较大的应变，提供具有柔顺的细胞，W适应 小的变形，同时在施加较大的应力时加强他们。参见参考文献[22]。[0095] 测量单个轴突的弹性随后进行。参照图5A，参见参考文献[46]，描绘的曲线用于估 计的弹性模量，其作为15个百分比压痕的函数，表示为EM 1-15, W每个30秒的间隔在一个 DRG轴突上执行的力-距离曲线，表示在第一 10-20%的压痕的高弹性模量可变性。悬臂的最 大（100%)压痕对应于轴突高度的约一半。参照图5B，描绘了平均弹性模量和是否采用长春 碱(5ηΜ-5μΜ)处理的至少10个海马和10个DRG轴突的标准偏差。为了比较在不同条件下处理 的不同轴突的弹性模量，本发明人考虑在30%压痕化Μ30%)的平均弹性模量，当该值非常 相似于在10-40%的弹性模量，但表现出较低的变异。此外，在30%压痕，加强作为压缩的函 数的轴突并不如在50%或更高的压痕明显。如从图5Β中的插入表明显看出，增加的长春碱 浓度降低平均ΕΜ30%和曲线的斜率。参照图5C，本发明人图示描绘的模型的比例为0.6mmX 1.0mm轴突，其由附连到AFM悬臂的20mm珠压缩，第一图像500A。在第二至第屯图像500B至 500G中，描绘了增加的压缩对轴突的影响，表示线粒体510、小泡520、在下轴突结构内的微 管蛋白和肌动蛋白W及在上轴突结构中的神经丝。[0096] 因此，在图5A和5B中所示的测量允许确定是否海马和DRG轴突对机械性损伤的不 同易感性由因不同的细胞骨架结构的弹性差异确实影响。弹性模量量化了材料在力被施加 到它时非永久性(弹性)变形的倾向，其中更硬的材料具有较高的弹性模量。通过使用经修 改的赫兹接触模型，本发明人计算出了轴突弹性模量，W容纳样品的几何形状，将轴突认为 是由球体压缩的圆柱体。本发明人发现，DRG轴突的弹性模量在每个压痕深度(ρ 10-5)比海 马轴突低约20%。平均弹性模量的变化与悬臂压痕的深度强烈相关，且弹性模量在测试的 所有轴突中的30%压痕之后不断增加，参见图5Α和5Β。在生物样品的弹性模量中的依赖深 度的增加已由不同的组报告，表明细胞硬度随着压缩增加而增加，但运种效果的原因尚未 阐明，参见参考文献[10]。在一般情况下，细胞对施加的力的响应可W分成两部分，第一部 分是机械响应，参见参考文献[23]到[25]，其简单地包括细胞承重结构的变形，而第二部分 是生化信号响应，运可能导致大多数力诱导的表型改变，参见参考文献[26]至[2引。然而， 尚未详细了解的是，应变即力如何通过不同的细胞内结构传播，参见参考文献[29]。[0097] 细胞内环境可能在容纳压缩力、引发不同路径和修改胞浆结构W避免重大损失方 面非常有活力。因此，了解轴突刚度的起源是至关重要的，W防止轴突损害和随之而来的神 经功能障碍。为了测试在轴突刚度方面的依赖深度的增加是否是由基底或细胞骨架阻力引 起的，本发明人评价长春碱处理的轴突的弹性模量。作为百分比压痕的函数的弹性模量曲 线的斜率随增加的长春碱浓度成比例地减小，参见图5B，确认细胞骨架阻力负责轴突刚度 方面的依赖深度的增加。采用5nM长春碱的处理显著降低EM30 %(p 0.001)，采用5nM长春 碱处理的轴突的弹性模量曲线的其余斜率可能是由于在长春碱处理之后仍然存在的肌动 蛋白丝的刚度。[0098] 对于发生对损伤的差别轴突阻力的本发明人的假设是，不同的轴突部件在轴突的 机械阻力方面发挥的主要作用，运取决于轴突(压痕深度）的变形和容纳应力的组件容量。 运种假设由我们的数据加强，表明轴突弹性模量的依赖深度的增加与细胞骨架的完整性成 反比，参见图5A和5B。本发明人提出，在10%压痕观察的弹性模量的高变化由末端下的感测 轴突运输的AFM引起，因为在10%压痕，轴突管腔不能充分地降低成损害轴突运输，参见第 Ξ图像500C。在适度压缩，例如30%，轴突管腔减小且线粒体W及较大的小泡开始积累，然 后AFM末端感测轴突细胞骨架的阻力，除了一些轴突运输之外，第四图像500D。随着压缩进 一步加深，轴突运输变得越来越阻塞，轴突弹性模量的可变性减小，参见图5A，且对压缩的 轴突响应变得更均匀，运表明悬臂正压缩轴突细胞骨架，参见第五图像500E。对压缩的细胞 骨架阻力是有限的，并且当采用较大的力（分别为0.化N或4nN)压缩海马或DRG轴突达10分 钟W上时，不可逆的变化发生且细胞骨架倒塌，参见第六图像500F。轴突运输在压缩释放之 后未恢复，且轴突被分为两个部分，参见第屯图像500G。运表示确定轴突在损坏之后是否会 被切断或恢复的因素是细胞骨架的弹性和完整性。[00\"] C:讨论[0100] 轴突变性的机理在外伤性损伤和慢性神经变性疾病方面非常相似。用于轴突损失 的提出的模型是神经损伤导致轴突运输的中断，FAS的形成，增加轴突内巧水平，线粒体功 能障碍，W及依赖巧的细胞骨架分解(对于最近的评论，参见参考文献[2]和参考文献[30]。 在轴突损伤后不久，巧流入已被证实诱导蛋白酶激活和线粒体膜通透性转换孔的打开，导 致病理性肿胀，功能丧失，W及局部能量衰竭，参见参考文献[1]、[2]、[31]和[32]。主微管 损坏还表明在创伤之后发生数分钟，参见参考文献[2]、[6]、[16巧日[33]。总之，运些事件被 认为代表导致轴突断开和变性的终端事件。轴突不断受到外力和内力的机械性刺激，但是 当力超过某个阔值时，结果是不可逆的损伤和轴突变性。定量力是了解最终导致神经元损 伤的不同阶段的事件的序列的第一步骤。一些小组已经研究了对于CNS和PNS轴突的损伤的 压力阔值。[0101] 然而，通过使用根据本发明实施例的微流体结构，不存在的轴突样品且更具体地 说可W通过轴突/神经生长实现的单个轴突样品已经受阻(受限)且已在没有周围神经环境 的干扰下被作出。实际上，对于PNS神经的轴突损伤的压力阔值被估计在30mm化(4kPa)，但 是采用20mmHg (2.7kPa)的压缩表明降低PNS神经内的血流，且30mmHg (4k化）的压力被描述 成损害轴突运输，并且引起神经、水肿、神经脱髓銷内部的压力的持续上升，参见参考文献 [34]至[37]。在CNS中，重症监护室的基石包括监测和管理病人的烦内压力（通常在0 P 1.3k化之间），且治疗的目的是在其超过P 2.0-2 .化化时减少烦内压力，参见参考文献 [3引。运些限制高于本发明人已发现的那些，因为它们评估压力在整个组织中造成的后果， 而本发明人的研究已经特别注重于通过对样品生长和样品呈现的微流体装置的开发的单 轴突响应，从下面关于本发明实施例的说明是显而易见的。在本发明人研究之前的文献中， 没有其他研究评估单轴突对由采用在子纳米级牛顿比例尺上的力的局部压缩引起的损伤 的响应，本发明人可W将我们的值与其进行比较。此外，没有可用的模型来评估在医院、急 救和现场环境内测量的全局烦内压如何转换成在不同的大脑微环境上的局部压力W及增 高的烦内压如何可能会直接影响单轴突。围绕轴突的间质液可W充当减震器或增强器，且 不同的情况比如外伤、水肿、血管问题、脑肿瘤、中风、感染、神经退行性疾病、甚至手术可W 显著导致可能会导致变性的轴突压力的增加。轴突的动态变形在脑外伤时很少会导致初级 断开，参见参考文献[1]、[4]和[39]。相反，在设及轴突运输的聚焦损伤的聚焦轴突变化之 后，断开发生贯穿大脑，比如本发明人分别在图3A至5C观察到的FAS。因此，在上面关于图1 至图5C所呈现的实验结果中，本发明人已利用原子力显微镜作为机械工具和成像仪器来局 部地压缩DRG和海马轴突。本发明人已经能够通过使用根据本发明实施例的微流体装置来 证明孤立离散的DRG轴突比孤立离散的海马轴突更耐压缩且更具弹性。本发明人的建议是， 细胞骨架成分的差异反映在轴突的粘弹性质中，因此在对损坏的轴突阻力方面发挥显著作 用。[0102] 值得注意的是，轴突细胞骨架的主要组分的比例和结构在开发和髓銷形成过程中 变化，参见参考文献[40]。脱髓銷是在不同的变性疾病中（在CNC比如多发性硬化或脑白质 营养不良和在PNS比如Guillain-Barre/综合征或进行性神经性脾骨肌萎缩症）的常见事 件，已被证明增加神经丝密度，减少微管密度，并且放慢在PNS和在CNS中的轴突运输，参见 参考文献[40]。本发明人提出，在细胞骨架组成中的运些生理和病理变化改变轴突的粘弹 性，并且有助于提高或降低对损害的轴突阻力。[0103] 在现有技术内，对轴突变性的绝大多数研究都集中到由轴突损伤引发的生化信号 事件上。由本发明人所得到的结果表明，轴突的机械性能还在决定损伤后的轴突命运方面 发挥显著作用，并且运些不能如采用生化信号那样从大块样品测量或分析获得。增长单轴 突或少量群集轴突的能力允许新的一代，W及发明人的知识、重复性、和精确的模型来研究 设及轴突变性的不同参数。此外，同时使用由本发明实施例提供的原子和光学显微镜工具 来同时压缩和成像W评估轴突完整性允许设及轴突损失比如细胞信号级联、力学传感器的 活性、W及静电变化的不同的事件。从实验观察和单个及少量轴突的测量得出的模型在作 为声信号的神经脉冲传播的基础上对于最近的讨论特别重要，参见参考文献[41]。一些科 学家声称，动作电位实际上是声脉冲或孤子，参见参考文献[42]。沿着相同的线，其它研究 表明，二维压力脉冲存在于脂质层中，并且是热力学起源，参见参考文献[43]，运些脉冲可 在细胞-细胞和蛋白质-蛋白质通信中起重要作用。通过使用AFM及弹性特性的随后变化，膜 等的变形应清楚地改变运种波的传播，打开口来检验运些假设，W相当于物理效应本身的 规模在很好受控的样品环境内。本发明的实施例支持神经元/轴突样品的生长、呈现和分 析，W探讨对神经元功能、损伤、或生长和软物质中的动作电位的传播的化学和物理应力。[0104] D:微流体细胞结构技术[010引在由神经外组织的扩张引起的创伤性脑损伤或神经压缩之后，轴突变性被认为是 暂时和永久残疾的常见潜在原因。如上面关于来自本发明人的研究数据所述，W支持高清 晰度、W几微米和微升的尺度的小区域/体积测量的方式，在所限定的生长流体环境和化学 条件下，通过使用实时成像技术，逐渐轴突压缩对分离的轴突的效果的分析要求配置支持 生长的生物样品和配置单轴突、少量的相关神经元等。相比于现有的模型，中枢或外周神经 束要么视神经切断要么粉碎，导致全局轴突损伤、神经胶质反应和变性。[0106] 因此，本发明的实施例用于控制施加在轴突的精确区域上的持续时间和力，使得 损伤能够再现并在微米分辨率观察和比较从胞体等距离受伤的各个轴突。本发明应用微流 体、活细胞成像和AFM来准确地计算中断轴突运输所需的力，而不损害轴突生存，中断轴突 运输和选择性地诱导在分离的轴突中的轴突变性，并计算DRG和海马轴突的弹性模量。[0107] 很难研究体内的轴突压缩。轴突由不同类型的组织、静脉和动脉包围，运妨碍评估 对压缩的单轴突响应。此外，轴突成像是相当困难的，因为轴突可能非常薄、长并形成大脑 内十分复杂的网络。体外神经元培养W完全不同于体内的方式组织，区分体外轴突和树突 是非常具有挑战性的。参照图6,分别示出了第一至第四图像600A至600D，表明根据本发明 实施例的微流体室对现有技术的效率。参照第一图像600A，示出了体外生长的神经元，已随 机组织，而在第二图像600B中，神经元通过定向生长而生长有一定程度的组织。第Ξ图像 600C示出了的图像由Santiago Ramony Cajal获取，用于为体内生长的神经元的形态，其非 常类似于在用于在根据本发明实施例的微流体室中生长的神经元的第四图像600D中示出 的。[0108] D1:用于第一代和第二代微流体装置的设计基础[0109] 使用与微流体结合的微制造技术，本发明人已经建立的设计在第一图像700A中示 出，采用两个隔室，由在图7中的第一图像700A中的隔室710示出，它们通过多个微通道彼此 连接，由图7中的第一图像700A中的区域720示出。因此，在第一图像700A中示出的设计允许 控制细胞在微流体环境被生长，允许调查药物化合物、药物制度等，它们与细胞粘附和迁移 率等干扰，或者可W影响突触等内的电化学过程。在背景中描述的现有技术内，类似的技术 仅支持神经元的研究。然而，本发明人已建立了新的设计和设计特征，可W实现更宽范围的 细胞的培养，同时降低所需的药物和/或细胞的体积，同时支持扩展的培养持续时间和增加 培养的效率。[0110] 有利地，本发明的实施例显著降低显著减少对试剂和样品的实验室成本的介质和 药物化合物的所需的体积。有利地，本发明的实施例还允许显著减少所需的细胞的数量，通 过整体体积的减少W及通过在微流体结构内的增加的保留效率，从而显著减少使用动物来 提供运些细胞W及花在细胞和试剂制备上的时间。有利地，微流体结构也被设计成在实验 室条件内使用和开发，而不需要特殊的涂层、特殊的盖玻片、或用于测量和检查设备例如光 学显微镜的特殊适配器。[0111] 有利地，例如基于设计变化还可W使用本发明的实施例，W向结构提供上文和下 面所述的好处，其在从单个细胞到群组细胞的范围的细胞规模和全体细胞W及从几微米到 几千微米的尺寸上支持培养和表征。[0112] 参考图7,相对于现有技术解决方案中的两个或多个掩模，然后在制造根据本发明 实施例的微流体结构所需的单一掩模的第二图像700B中示出。同样在图7中示出，在第Ξ图 像700C中是PMDS微流体结构730,其坐在玻璃培养皿内并填充有仅用于视觉效果的彩色染 料。[0113] 参照图8,在第一图像800A中，示出了细胞的示意图，其接种根据本发明实施例的 微流体结构。如图所示，微流体结构的一侧比如在图7中的第一图像700A中示出呈现包括第 一和第二阱(we 11) 820和连接室830连同微通道840，其将连接室830互连到未示出的另一连 接室W及其相关的阱。因此，移液管810可被用于分配介质（为清楚起见未示出）中的细胞 850。[0114] 在现有技术微流体装置内，比如体现在美国专利7419822和背景中引用的其他专 利中，连接室具有约100皿的深度，相比于第一和第二阱的深度，例如3mm，使得具有细胞的 介质从第一和第二阱(介质被移入其中）通过流体静压流至连接室。然后，深度约100皿的连 接室连接到微通道的阵列，其深度例如3皿基本上小于连接室，使得再次采用流体静压来驱 动介质朝向微通道。运种设计示出在图10中的第一示意1000A和第一光学显微照片1000D 中。[011引与此相反，在图7中的第一图像700A和第一图像800A中所示的微流体装置具有用 于第一和第二阱820的约3毫米的深度，使得介质从阱820(介质通过连接室830分配到其中） 流向在连接室830的另一端的另一阱810。然而，本发明实施例内的连接室830和微通道840 的深度是相同的，使得没有介质且其中的细胞的流体静压驱动朝向微通道。相比于现有技 术装置(其采用连接第一和第二阱之间的室几何形状的平滑低阻力），根据本发明实施例的 连接室830提供流体流动的阻力和限制，W增加细胞保留在微通道或其内的效率。因此，如 在第一图像800A中示出，来自流体被移入到其中的第一阱820的出口870相对于阱820的直 径很窄。类似地，从连接室进入第二阱820的出口 870相对于连接室830的宽度很窄。另外，随 着介质从第一阱820行进至第二阱820,连接室在微通道阵列的端部的端壁具有相对于流体 流动方向的高角度。因此，随着介质流动，高角度壁860和窄出口 870导致增加细胞保留于连 接室内。结果分别示出在第二和第Ξ图像800B和800C中，其中本发明人已经观察到细胞在 靠近壁的数量增加，由第二图像800B中的蓝色箭头所示，W及在微通道的入口处，由第Ξ图 像800C中的箭头所示。[0116] 有利地，本发明人可W适应微通道的横截面和长度，允许微流体结构用于不同细 胞类型的粘附和迁移率的研究。当培养神经元时，例如细胞体保持在它们被加载到的连接 隔室830中，而轴突生长，并且通过微通道840导航到微通道840的另一侧上的另一连接隔 室。可替代地，为了研究寄生虫和感染性疾病，主细胞可被接种在装置的一侧，寄生虫进入 装置的另一侧，且药物化合物被添加到一侧或另一侧，W便研究哪些通过通道吸引或抑制 寄生虫迁移来感染细胞。同样地，本发明的实施例可W用于研究抑制癌细胞侵袭的药物化 合物;免疫细胞反应;损伤阔值和/或轴突、神经元等的恢复特性；W及由评估精子细胞通过 微通道的运动来执行生育力测试。显而易见的是，用于利用关于本发明实施例所述的技术 的装置的其他应用将存在超出本专利说明书中所描述的几个。[0117] 通过相对于在短膜虫期阶段、灰色斑点的Typanosoma锥虫的分析的根据本发明实 施例的微流体结构的微通道/连接室的第一至第Ξ图像900A至900C，图9示出了一种运样的 应用，从而引起人类的南美锥虫病，并且通过在拉下美洲和美国南部发现的蚊子的叮咬被 传送。运种寄生虫进入血液并筑巢于屯、脏，最终因屯、脏不足而导致病人死亡。第一图像900Α 示出了将寄生虫加入到微流体结构的右隔室和将屯、脏蛋白加入到左隔室的结果。在第二图 像900Β中，运是在添加寄生虫后不到2分钟拍摄的，很清楚的是，寄生虫已开始游过通道朝 向左隔室，并且在第Ξ图像900C中，通道中的寄生虫的数量增加，同时若干种寄生虫陷在通 道入口处。通过调节人类蛋白，可W表明寄生虫被吸引到特定的人类蛋白。[0118] 下面参照图10,分别示出了第一至第Ξ图像1000Α至1000C和第一至第Ξ光学显微 照片1000D至1000F。第一图像1000Α和第一光学显微照片1000D示出了根据美国专利 74 19822的现有技术的微流体结构，W下简称为822装置，其中的变体由Xona Microfluidics销售。明显的是，该装置具有带有大阱的大足迹，且低阻力介质从一个阱流 到另一个阱，用于或上部或下部隔室。第二图像1000B和第一光学显微照片1000E示出了根 据本发明实施例的第一代微流体结构的微流体结构，W便减轻在822装置内的限制。因此， 阱现在连接到微流体结构的连接室，其中开口直接从阱到连接室。运增加了细胞保留，甚至 没有限制。[0119] 第Ξ图像100